太陽(yáng)光不僅是植物生長(zhǎng)的能量來(lái)源，還是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的關(guān)鍵信號(hào)。光敏色素是植物的紅光/遠(yuǎn)紅光感受器，作為植物的“眼睛”扮演重要角色。當(dāng)下全球氣候變化愈加頻繁、耕地資源逐步縮緊，維護(hù)全球糧食安全是一嚴(yán)重挑戰(zhàn)。過(guò)去近一個(gè)世紀(jì)，農(nóng)作物產(chǎn)量的不斷提高得益于越來(lái)越耐密植的作物新品種。將來(lái)作物產(chǎn)量進(jìn)一步提高也將繼續(xù)依賴(lài)于培育更耐密集種植的新品種。由于密植遮蔭環(huán)境中植物的感光機(jī)理和耐密高產(chǎn)性狀均和植物光敏色素蛋白息息相關(guān)，闡明植物光敏色素響應(yīng)以及傳遞光信號(hào)的機(jī)制將有助于改善作物密植性能及對(duì)復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)性，從而為糧食安全的保障做出貢獻(xiàn)。
高等植物主要編碼以光敏色素A（phyA）和光敏色素B（phyB）為代表的兩類(lèi)光敏色素，其中phyB是介導(dǎo)可逆紅光響應(yīng)的主要紅光受體。光敏色素通過(guò)發(fā)色團(tuán)PΦB在紅光吸收態(tài)（Pr，基態(tài)）以及遠(yuǎn)紅光吸收態(tài)（Pfr，激活態(tài)）之間進(jìn)行可逆轉(zhuǎn)變。擬南芥phyB被光激活后，可以直接與一類(lèi)光敏色素互作因子（phytochrome-interacting factor，PIF)互作，傳遞光信號(hào)并調(diào)控下游基因表達(dá)，促進(jìn)光形態(tài)建成。因此phyB和PIFs構(gòu)成了植物響應(yīng)周?chē)猸h(huán)境的關(guān)鍵信號(hào)模塊。擬南芥中8個(gè)PIF成員（PIF1-8）均包含兩個(gè)重要結(jié)構(gòu)域：N端為結(jié)合phyB-Pfr的激活態(tài)結(jié)合域（Active-PHYB Binding motif，APB），其C端為結(jié)合DNA的bHLH二聚化結(jié)構(gòu)域。在黑暗條件下，phyB-Pr定位于細(xì)胞質(zhì)中，PIF1/3/4/5在核中作用驅(qū)動(dòng)幼苗暗形態(tài)建成的發(fā)育過(guò)程（下胚軸伸長(zhǎng)，子葉閉合）。一旦幼苗感知紅光，phyB-Pfr入核進(jìn)而負(fù)調(diào)控上述PIFs，抑制下胚軸伸長(zhǎng)和促進(jìn)子葉展開(kāi)，并維持植物光生長(zhǎng)形態(tài)。盡管2022年美國(guó)Vierstra團(tuán)隊(duì)在Nature發(fā)文揭示了phyB-Pr的結(jié)構(gòu)，但phyB-Pfr及其識(shí)別PIF的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)及其調(diào)控機(jī)理仍不清楚。
2024年9月24日，北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院王繼縱課題組與鄧興旺課題組合作在Cell發(fā)表了題為Light-induced remodeling of phytochrome B enables signal transduction by phytochrome-interacting factor的研究論文，揭示了長(zhǎng)期以來(lái)期待的phyB光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的最初反應(yīng)機(jī)制。
該研究解析了模式植物擬南芥光激活態(tài)phyB-Pfr以及不依賴(lài)于光的組成型激活突變體phyBY276H分別結(jié)合下游信號(hào)分子PIF6的復(fù)合物高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（分辨率依次為3.1 ?，3.2 ?）。基于分子結(jié)構(gòu)分析、結(jié)合突變體蛋白光譜性質(zhì)測(cè)定、體外以及半體外生化實(shí)驗(yàn)表征、以及轉(zhuǎn)基因植物的表型分析，揭示了光激活phyB由Pr轉(zhuǎn)變?yōu)镻fr的詳細(xì)分子機(jī)制，并提出了phyB和PIF之間“誘導(dǎo)-契合”的相互作用模型，填補(bǔ)了植物光敏色素信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制研究的一個(gè)關(guān)鍵空白。
由于全長(zhǎng)PIFs蛋白存在大量無(wú)序結(jié)構(gòu)，體外重組表達(dá)以及組裝phyB-PIF全長(zhǎng)蛋白復(fù)合物存在相當(dāng)大的困難。考慮到系列文獻(xiàn)報(bào)道中PIFs的APB motif（N端100個(gè)氨基酸）足以介導(dǎo)其與phyB在體內(nèi)及體外互作，研究者選取了結(jié)合能力最強(qiáng)的PIF6-APB（PIF6-100，僅N端100個(gè)氨基酸）進(jìn)行phyB-PIF的復(fù)合物組裝并制備冷凍樣品。最終成功解析得到了phyB-Pfr-PIF6以及缺失HKRD結(jié)構(gòu)域（僅含N端908個(gè)氨基酸）的phyBY276H-908-PIF6復(fù)合物的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析表明phyB-Pfr在光激活之后發(fā)生大規(guī)模結(jié)構(gòu)重排，其光感應(yīng)模塊（photosensory module, PSM）從Pr狀態(tài)下“頭對(duì)尾”轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>Pfr狀態(tài)下“頭對(duì)頭”二聚體，且PIF6-APB單體結(jié)合在phyB-Pfr二聚體界面的一側(cè)，組成phyB-PIF6三聚體。此外，phyBY276H-908-PIF6復(fù)合物結(jié)構(gòu)與phyB-Pfr-PIF6幾乎完全一致（圖1）。
圖1. phyB-Pfr-PIF6（B）和phyBY276H-PIF6（C）均為不對(duì)稱(chēng)三聚體
為了闡明光激活驅(qū)動(dòng)phyB的結(jié)構(gòu)重排，作者細(xì)致比對(duì)了之前文獻(xiàn)報(bào)道的phyB-Pr及本研究獲得的phyB-Pfr結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)發(fā)色團(tuán)PΦB分子在吸收紅光后，其D環(huán)翻轉(zhuǎn)了180?，并且和口袋中的系列氨基酸重新建立互作網(wǎng)絡(luò)（圖2A，左），最終導(dǎo)致PHY結(jié)構(gòu)域里與其互作的舌狀突出結(jié)構(gòu)發(fā)生由β片層到α螺旋的構(gòu)象轉(zhuǎn)變（圖2A，右）。結(jié)構(gòu)分析表明，絲氨酸S584對(duì)于穩(wěn)定α螺旋形式的舌狀結(jié)構(gòu)非常重要（圖2A，右），進(jìn)一步的體外生化以及轉(zhuǎn)基因植物表型分析證明了S584對(duì)于維系phyB-Pfr激活狀態(tài)和phyB信號(hào)通路至關(guān)重要（圖2B）。
圖2. 光誘導(dǎo)PΦB分子（A，左）和PHY結(jié)構(gòu)域舌狀突出結(jié)構(gòu)（A，右）的構(gòu)象轉(zhuǎn)變及功能驗(yàn)證（B）
在Pr狀態(tài)下，phyB的C末端結(jié)構(gòu)域PAS2以及HKRD與N末端結(jié)構(gòu)域GAF和PHY互作以維系“頭對(duì)尾”二聚體構(gòu)象。而在phyB-Pfr中，其PHY結(jié)構(gòu)域的舌狀突出結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>α螺旋后，會(huì)直接和Pr狀態(tài)里的PAS2結(jié)構(gòu)域發(fā)生空間沖突（圖3A，左；圖3B，左），從而破壞Pr狀態(tài)下PAS2和PHY結(jié)構(gòu)域之間的廣泛互作，這會(huì)進(jìn)一步破壞HKRD和PHY結(jié)構(gòu)域（圖3A，左；圖3B，中），以及HKRD和GAF結(jié)構(gòu)域（圖3A，右；圖3B，右）之間的分子內(nèi)互作，這一系列的構(gòu)象變化完全打破Pr狀態(tài)下的“頭對(duì)尾”結(jié)構(gòu)，最終激活phyB。此外，缺失HKRD結(jié)構(gòu)域的phyB截短體蛋白（phyB-908，僅含N端908個(gè)氨基酸）在光激活之后傾向于單體形式存在（圖3C），進(jìn)一步佐證了phyB-Pr在光激活后，原來(lái)由N端和C端模塊互作維系的“頭對(duì)尾”二聚體被打破，進(jìn)而形成phyB-Pfr。
圖3. PHY 結(jié)構(gòu)域舌狀突出結(jié)構(gòu)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變驅(qū)動(dòng)phyB-Pr重構(gòu)形成phyB-Pfr（A，B）及生化驗(yàn)證（C）
光激活后的phyB-Pfr分別利用其N末端的NTE結(jié)構(gòu)域以及由整體N末端結(jié)構(gòu)域形成的“頭對(duì)頭”二聚體，來(lái)識(shí)別和結(jié)合PIF6-APB的N末端和C末端（圖4A）。PIF6-APB的N末端通過(guò)形成一個(gè)β發(fā)夾結(jié)構(gòu)（PIF6-APB-β）與phyB-Pfr的NTE結(jié)構(gòu)域發(fā)生廣泛互作（圖4B），而phyB-Pfr二聚體結(jié)構(gòu)中另一分子phyB并不具備穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的NTE，表明NTE的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)是由PIF6-APB的結(jié)合所誘導(dǎo)形成的。此外，PIF6-APB的C末端通過(guò)形成一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)（PIF6-APB-α）同時(shí)與兩個(gè)phyB-Pfr的N末端結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生廣泛互作（圖4C），印證了PIF6-100促進(jìn)的phyB-908-Pfr的二聚化（圖3C）。作者進(jìn)一步通過(guò)系列生化、光譜實(shí)驗(yàn)表征、結(jié)合轉(zhuǎn)基因植物的表型明確了NTE結(jié)構(gòu)域以及N末端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的phyB-Pfr二聚化對(duì)于phyB-PIF互作的重要性。
圖4. phyB-Pfr的N末端結(jié)構(gòu)域?qū)?/span>PIF-APB的特異性識(shí)別（A）以及NTE結(jié)構(gòu)域特異性識(shí)別PIF-APB的N末端β發(fā)夾結(jié)構(gòu)（B），phyB-Pfr二聚體特異性識(shí)別PIF-APB的C末端α螺旋結(jié)構(gòu)（C）
兩個(gè)phyB-Pfr的結(jié)構(gòu)比對(duì)表明phyB-PIF6復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的phyB-Pfr形成了不對(duì)稱(chēng)的二聚體（圖5A），這些不對(duì)稱(chēng)性導(dǎo)致phyB-Pfr二聚體的另一側(cè)界面沒(méi)有足夠空間與PIF6-APB-β以及PIF6-APB-α形成合適的互作（圖5B）。作者進(jìn)一步通過(guò)pull-down以及Co-IP assay評(píng)估了溶液狀態(tài)下phyB和PIF-APB以及PIF-FL的互作模式，生化數(shù)據(jù)表明PIF3和PIF6的APB motif以及PIF1和PIF3的全長(zhǎng)蛋白均可以和phyB-Pfr二聚體形成摩爾比為1:2（2:4）的復(fù)合物。
圖5. 不對(duì)稱(chēng)的phyB-Pfr二聚體只能結(jié)合一個(gè)PIF6-APB單體
總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究揭示了“頭對(duì)頭”激活態(tài)phyB二聚體識(shí)別結(jié)合PIF6-APB的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，解決了光敏色素研究中光如何誘導(dǎo)phyB變構(gòu)激活并轉(zhuǎn)導(dǎo)PIF信號(hào)的關(guān)鍵問(wèn)題（圖6），為作物感光性狀的改造以及phyB相關(guān)光控基因表達(dá)的“光遺傳學(xué)”工具開(kāi)發(fā)提供了分子水平的精細(xì)圖紙。
圖6. 紅光激活phyB并轉(zhuǎn)導(dǎo)PIF信號(hào)的結(jié)構(gòu)機(jī)制模型
北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院、北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院王繼縱研究員和鄧興旺教授為該論文的通訊作者。北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院博士研究生王征東和宋艷萍、北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院科研助理王文鳳和趙迪迪、以及北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院林曉莉博士為論文共同第一作者。北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院趙珺博士、遲程博士和高級(jí)工程師徐斌、中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所博士研究生沈萌對(duì)本研究也做出了重要貢獻(xiàn)。冷凍樣品制備、樣品篩選和數(shù)據(jù)收集在研究院生物微觀結(jié)構(gòu)研究平臺(tái)完成。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目、山東省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目、山東省科技創(chuàng)新基金、中科協(xié)青年人才托舉工程、山東省泰山青年學(xué)者項(xiàng)目、北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院、濰坊現(xiàn)代農(nóng)業(yè)山東省實(shí)驗(yàn)室、小麥育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、北京大學(xué)蛋白質(zhì)與植物基因研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室相關(guān)經(jīng)費(fèi)的資助。
論文鏈接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)01023-7
專(zhuān)家觀點(diǎn)
萬(wàn)建民 院士（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究）
光照是植物生長(zhǎng)的能量來(lái)源，對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量起著決定性作用。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，提高作物種植密度是增產(chǎn)的重要途徑。然而，隨著密度增加，作物植株之間相互遮陰會(huì)加劇，造成植株莖稈增高、變?nèi)酰装l(fā)生倒伏、小穗和抗逆性減弱等突出問(wèn)題。因此，闡明植物感知光照的分子機(jī)理對(duì)提高作物光適應(yīng)能力和耐密性等具有十分重要的意義。光敏色素是植物的紅光、遠(yuǎn)紅光受體，是影響作物響應(yīng)光照變化的關(guān)鍵功能蛋白。自1960年首次以“光敏色素”命名這類(lèi)光受體以來(lái)，研究人員一直好奇光敏色素感知紅光/遠(yuǎn)紅光信號(hào)的機(jī)制。早在上世紀(jì)80年代末，研究人員在植物光敏色素phyA的電鏡照片中就看到了“Y”字形的蛋白顆粒。但是由于光敏色素屬于多結(jié)構(gòu)域光受體蛋白，植物內(nèi)源含量較低，且重組表達(dá)困難，研究人員主要通過(guò)對(duì)相對(duì)容易獲得的微生物來(lái)源光敏色素進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，植物光敏色素的結(jié)構(gòu)研究相對(duì)停滯。直到2014年，PNAS雜志發(fā)表了基態(tài)phyB光感應(yīng)模塊截短體的晶體結(jié)構(gòu)，2022年以來(lái)，來(lái)自于美國(guó)以及中國(guó)的多家單位相繼報(bào)道了全長(zhǎng)phyB及phyA基態(tài)的結(jié)構(gòu)，從而逐漸建立了光敏色素基態(tài)結(jié)構(gòu)特性的認(rèn)識(shí)。但植物光敏色素激活態(tài)結(jié)構(gòu)及光信號(hào)原初轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制仍不清楚，限制了基于激活態(tài)phyB結(jié)構(gòu)的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究。
這項(xiàng)研究首次報(bào)道了激活態(tài)植物光敏色素phyB結(jié)合標(biāo)志性下游信號(hào)分子PIF的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，揭示了廣泛研究的不依賴(lài)與光照的組成型激活突變體phyBY276H結(jié)合PIF的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，并結(jié)合多種研究方法，闡明了光照引起的激活態(tài)phyB結(jié)構(gòu)重排以及光敏色素蛋白和發(fā)色團(tuán)分子之間相互協(xié)調(diào)的動(dòng)態(tài)變化機(jī)制。這項(xiàng)研究充分回答了長(zhǎng)期以來(lái)研究人員關(guān)注的phyB感光激活機(jī)理，填補(bǔ)了激活態(tài)植物光敏色素結(jié)構(gòu)研究的空白，是生物學(xué)基礎(chǔ)研究的重大突破。同時(shí)，光敏色素激活機(jī)制的解析為精準(zhǔn)調(diào)控植物光響應(yīng)建立了基礎(chǔ)，對(duì)定向改良玉米、小麥、水稻等重要作物的感光性狀、培育耐密高產(chǎn)品種意義重大。
王海洋 教授（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)）
培育耐密植作物是提高作物單產(chǎn)的有效技術(shù)措施。株型是決定作物耐密性的關(guān)鍵因素之一。然而，密植容易誘發(fā)植物產(chǎn)生避蔭反應(yīng)，導(dǎo)致植株徒長(zhǎng)、莖稈變細(xì)、根系發(fā)育減弱、增加倒伏風(fēng)險(xiǎn)等不利后果。作為植物響應(yīng)紅光/遠(yuǎn)紅光信號(hào)的主要紅光受體，光敏色素phyB對(duì)于植物應(yīng)對(duì)外界光環(huán)境變化的適應(yīng)性生長(zhǎng)（株高、葉夾角、開(kāi)花時(shí)間等）至關(guān)重要，從而影響作物的株型、光合效率和產(chǎn)量。phyB被紅光激活后，通過(guò)與PIF蛋白直接互作傳遞光信號(hào)，進(jìn)而啟動(dòng)和維持光形態(tài)建成的發(fā)育過(guò)程。然而自1998年發(fā)現(xiàn)PIF是激活態(tài)光敏色素結(jié)合蛋白以來(lái)，雖然鑒定了部分影響phyB-PIF互作的關(guān)鍵位點(diǎn)，但激活態(tài)phyB與PIF蛋白互作的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)理目前仍然未知。這項(xiàng)研究通過(guò)解析了模式植物擬南芥光激活態(tài)phyB-Pfr以及不依賴(lài)于光的組成型激活突變體phyBY276H分別結(jié)合下游信號(hào)分子PIF6的復(fù)合物高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，揭示了phyB基態(tài)（Pr）在光激活后，其光感應(yīng)模塊（PSM）從Pr狀態(tài)下“頭對(duì)尾”轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>Pfr狀態(tài)下“頭對(duì)頭”二聚體。由于phyB-Pfr二聚體的不對(duì)稱(chēng)性，導(dǎo)致其僅一側(cè)能夠結(jié)合PIF并形成phyB-Pfr-PIF的三聚體。作者進(jìn)一步結(jié)合突變體蛋白光譜性質(zhì)測(cè)定、體外以及半體外生化實(shí)驗(yàn)表征、以及轉(zhuǎn)基因植物的表型分析，驗(yàn)證了絲氨酸S584、NTE結(jié)構(gòu)域以及N末端結(jié)構(gòu)域?qū)τ诮閷?dǎo)phyB-Pfr二聚化，phyB-PIF互作和phyB信號(hào)通路的重要性。該研究首次揭示了phyB光激活及最初光信號(hào)傳遞（與PIF互作）的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)，是近年來(lái)植物光敏色素信號(hào)傳導(dǎo)研究領(lǐng)域取得的又一個(gè)重大突破。研究成果可為培育耐蔭、耐密、抗倒伏、高光效作物新品種提供重要理論指導(dǎo)和基因資源。