2025年5月22日，北京大學現(xiàn)代農(nóng)學院楊建國研究員與崖州灣國家實驗室王憶平教授合作在Nucleic Acids Research期刊上發(fā)表題為Expanding the σ54-dependent transcription process with orthogonal designs的研究論文，提出并表征了一種改造細菌σ54因子實現(xiàn)正交轉錄系統(tǒng)的方法。
基于σ54因子的正交轉錄系統(tǒng)原理及優(yōu)勢示意圖
在合成生物學的實踐中，細菌宿主自身的遺傳機器為外源基因線路的運行提供動力，并從底層上控制著預期生物學功能的執(zhí)行。盡管合成生物學研究與應用所涉及的范圍極其廣泛，但導入宿主中的元件及模塊的穩(wěn)定運行始終是領域內的共性需求，其中可靠的轉錄行為起著首要且關鍵的作用。創(chuàng)制新型細菌正交轉錄系統(tǒng)將有助于豐富現(xiàn)有的合成生物學工具箱，為非模式細菌中提供正交化基因表達提供新策略，保障復雜基因線路的長期穩(wěn)定運行。
σ54因子是細菌RNA聚合酶（RNAP）中的一個可解離亞基，在RNAP全酶中負責與啟動子的特異性識別與結合。通過對σ54-啟動子復合體結構的分析，推測σ54的R455和R456兩個氨基酸殘基可通過氫鍵參與啟動子的?24區(qū)相互作用。利用文庫vs文庫篩選法，得到了一個正交的σ54因子變體σ54-R456H。正交性測試實驗表明，σ54-R456H僅可特異性識別與之適配的正交啟動子，而失去了識別宿主自身啟動子的能力。結合飽和突變、文庫篩選等方法，后續(xù)發(fā)現(xiàn)σ54-R456H，R456Y和R456L可在細胞內同時使用，構成一組互相正交的σ因子組。考慮到σ54的R456位點在不同細菌類群中的保守性，將相同突變體導入3種非模式細菌底盤中后，均能夠在其中實現(xiàn)正交轉錄，表明這套正交轉錄系統(tǒng)可在遺傳背景各異的諸多細菌中發(fā)揮功能。進一步將不同類型的上游激活蛋白（bacterial Enhancer Binding Protein，bEBP）載入該系統(tǒng)，可實現(xiàn)對環(huán)境信號（如溫度）或化學信號（如氧氣濃度）的響應，實現(xiàn)依賴于特定信號的下游正交轉錄輸出。上述結果表明，該正交轉錄系統(tǒng)本身是高度模塊化的，在非模式細菌中均能發(fā)揮理想的效果；且其內部也是模塊化的，bEBP可自由調整以實現(xiàn)更智能的自動調控。研究進一步測試了該系統(tǒng)用于定制正交的復雜生物學功能的潛力。選取蔗糖代謝途徑、生物固氮、邏輯門等作為應用場景，使用σ54-R456H適配的正交啟動子控制相應基因的轉錄，發(fā)現(xiàn)僅可在該正交σ54因子存在時，下游的基因才可開始轉錄，產(chǎn)生預期的生物學表型。這些實驗表明，使用該系統(tǒng)可以方便地對基因線路進行正交化改造，即便對于6操縱子18基因的極復雜的生物固氮基因簇，該系統(tǒng)也可完全可以勝任。
綜上所述，本研究通過對σ54與其啟動子的識別過程進行改造，獲得了三套新的σ54識別偏好性，它們與宿主自身的轉錄機器互相正交。基于σ54因子的正交轉錄系統(tǒng)具有通用性廣、可調性佳、模塊化程度高、易于使用等優(yōu)點，為實現(xiàn)正交基因表達提供了實用的補充方案，有助于在非模式菌株中實現(xiàn)多基因系統(tǒng)的組合控制及收斂調控，也為在根系微生物中實現(xiàn)高效聯(lián)合固氮提供了重要保障。
北京大學現(xiàn)代農(nóng)學院楊建國研究員和崖州灣國家實驗室王憶平教授為本論文共同通訊作者，北京大學前沿交叉學科研究院2020級PTN項目博士生劉逸珩為論文第一作者。北京大學現(xiàn)代農(nóng)學院博士生蔡舒怡、張子奕、謝卓婷以及北京大學生命科學學院博士生郭琛月參與了本研究。該研究得到了國家重點研發(fā)計劃項目、國家自然科學基金、農(nóng)業(yè)生物育種國家科技重大專項、基因功能研究與操控全國重點實驗室、崖州灣國家實驗室以及北京大學現(xiàn)代農(nóng)學院的資助。
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